Katika mchakato wa kufanya tafiti za kijeni, mara nyingi tunakumbana na sampuli za RNA zisizotosha, kwa mfano, kwa ajili ya kuchunguza uvimbe mdogo wa mdomo wa anatomia, hata sampuli za seli moja, na sampuli za mabadiliko mahususi ya jeni ambayo hunakiliwa katika viwango vya chini sana katika seli za binadamu.Kwa kweli, kwa kipimo cha COVID-19, ikiwa swabs haziko mahali pazuri au hakuna wakati wa kutosha wakati wa sampuli, saizi ya sampuli itakuwa ya chini sana, ndiyo maana Tume ya Afya na Upangaji Uzazi ilitoka siku mbili zilizopita na. kupita mtihani, na ikiwa sampuli ya asidi ya nucleic haikuchukua sampuli sita, unaweza kuripoti.
Unyeti wa kitendanishi ni muhimu kwa sababu tuna tatizo hili au tatizo hilo, kwa hivyo tunaweza kufanya nini ili kuboresha unyeti wa RT-PCR?
Kabla ya kujadili masuluhisho yanayowezekana, hebu tutaje matatizo mawili makubwa na hali tuliyotaja hivi punde.
Kwanza kabisa, tuna wasiwasi kuhusu upotezaji wa RNA wakati tuna idadi ya seli chache tu kwenye sampuli yetu.Iwapo mbinu za kitamaduni za kutenganisha na kusafisha zitatumika, kama vile njia ya safu wima au njia ya kunyesha na asidi ya nukleiki, kuna uwezekano mkubwa kwamba sampuli chache zitapotea.Suluhisho mojawapo ni kuongeza molekuli ya mtoa huduma, kama vile tRNA, lakini hata hivyo, hakuna hakikisho kwamba jaribio letu la urejeshaji ni sawa.
Kwa hivyo ni njia gani bora zaidi?Chaguo nzuri kwa seli zilizokuzwa au sampuli za microanatomical ni kutumia lysis ya moja kwa moja.
Wazo ni kugawa seli kwa dakika 5, kutolewa RNA kwenye suluhisho, kisha kusimamisha majibu kwa dakika 2, kisha kuongeza lysate moja kwa moja kwenye majibu ya maandishi ya nyuma ili hakuna RNA iliyopotea, na hatimaye kuweka cDNA inayosababisha moja kwa moja. kwenye majibu ya wakati halisi.
Lakini vipi ikiwa, kwa sababu ya sehemu ndogo ya kuanzia au kiasi kidogo cha usemi wa jeni lengwa, tunaweza kuchakata RNA yote na bado tusitoe violezo vya kutosha kupata mawimbi mazuri ya wakati halisi?
Katika kesi hii, hatua ya awali ya amplification inaweza kuwa muhimu sana.
Ifuatayo ni mpango wa kuongeza usikivu baada ya unukuzi wa kinyume.Kabla ya kuanza, tunahitaji kuuliza ni shabaha zipi tunazovutiwa nazo, ili kubuni viasili mahususi kwa ajili ya malengo haya ya ukuzaji wa mapema.
Hii inaweza kupatikana kwa kuunda kitangulizi kilichochanganywa na hadi jozi 100 za vianzio na mzunguko wa majibu wa mara 10 hadi 14.Kwa hivyo, Mchanganyiko wa Master iliyoundwa mahsusi kwa mahitaji haya inahitajika ili kukuza mapema cDNA iliyopatikana.
Sababu ya kuweka idadi ya mizunguko kati ya 10 na 14 ni kwamba idadi hii ndogo ya mizunguko inahakikisha unasibu kati ya malengo mbalimbali, ambayo ni muhimu kwa watafiti wanaohitaji maelezo ya kiasi cha molekuli.
Baada ya ukuzaji wa awali, tunaweza kupata kiasi kikubwa cha cDNA, ili usikivu wa kutambua kwenye sehemu ya nyuma uboreshwe sana, na tunaweza hata kupunguza sampuli na kufanya miitikio mingi ya wakati halisi ya PCR ili kuondoa makosa yanayoweza kutokea nasibu.
Muda wa kutuma: Apr-11-2023